Em caso de contato acidental: enxágüe imediatamente a região atingida com abundante água, por pelo menos 15 minutos e procure imediatamente orientação médica.

Reagentes necessários, não fornecidos:

• Clorofórmio; pode ser substituído por 1-bromo-3-cloropropano (5)
• Isopropanol
• Etanol

ISOLAMENTO de ácidos nucleicos:

Esta metodologia é eficaz para o isolamento de RNA de diferentes espécies e amostras, raramente observada através de outros métodos (4). Utilizando-se o BRAZOL para extração de RNA, o tempo de ensaio é em torno de uma hora. O protocolo prevê basicamente a extração de RNA total a partir de 100 µL de volume de amostra podendo ser realizado em tubos de 500 µL. Para volumes maiores, ou outro tipo de amostras, deve-se manter a proporção entre os diferentes reagentes bem como a utilização de tubos com capacidade maior. Aconselha-se realizar todo o procedimento em ambiente controlado (15°C a 30°C), observando sempre a utilização de ponteiras e tubos RNAse free, bem como os reagentes adicionais, acima indicados em baixa temperatura.PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO:

1 – Homogeneização:

1. Tecidos: 1 mL de Brazol para cada 50-100 mg de tecido, mecanicamente homogeneizado. O volume da amostra não deve exceder 10% do volume de Brazol usado para homogeneização.
2. Células de crescimento em monocamadas: Lisar as células coletadas diretamente da placa de cultura adicionando 1 mL de Brazol para cada 3,5 cm de diâmetro da placa e passando o lisado de células várias vezes pela pipeta. A quantidade de Brazol adicionada é baseada na área da placa de cultura (aproximadamente 1 mL para 10 cm2) e não no número de células presentes. Uma quantidade insuficiente de Brazol poderá resultar na contaminação do RNA isolado, com DNA.
3. Células de crescimento em suspensão: Centrifugar as células até formar um pellet. Lisar as células com Brazol através de repetidas pipetagens. Utilizar 1 mL do reagente para cada 5 – 10 x 106 de células animais, de plantas ou de leveduras, ou para 1 x 107 células bacterianas. A lavagem excessiva das células antes da adição de Brazol deve ser evitada porque aumenta a possibilidade de degradação do mRNA.
4. Sangue total: Adicionar 1 mL de BRAZOL para cada 300 mL de amostra

2 – Agitar os tubos por inversão ou com auxílio de agitador, tipo vôrtex, por 2 minutos e adicionar 250 mL de clorofórmio gelado. Agitar novamente;

3 – Centrifugar as amostras a 12.000 x g (aproximadamente 10.000 rpm) a 4°C, por 20 minutos;

4 – Transferir o sobrenadante para novos tubos contendo 500 mL de isopropanol gelado no processo de extração de RNA ou 500 mL de etanol absoluto gelado para o DNA;

5 – Agitar os tubos por inversão durante 2 minutos;

6 – Centrifugar a 12.000 x g a 4°C, durante 15 minutos;

7 – Desprezar o sobrenadante por aspiração ou cuidadosa decantação, observando para não eliminar o pellet ;

8 – Lavar o pellet com 500 mL de etanol 70%, homogeneizar por inversão e centrifugar a 12.000 x g a 4°C, durante 10 minutos;

9 – Desprezar o sobrenadante como na etapa 7, cuidando para não aspirar o pellet;

10 – Dissolver o pellet em água estéril ou em tampão TE 1X estéril;

11 – Quantificar a concentração final dos ácidos nucleicos obtidos através de leitura em espectofotômetro ou estimando a concentração em géis de agarose, para o RNA trabalhar em condições desnaturantes;
As amostras assim processadas estão prontas para serem utilizadas em reações de amplificação e demais aplicações da Biologia Molecular

Referências bibliográficas:

1. Chomczynski P and Sacchi N (1987) Single step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 162, 156-159.
2. Chomczynski P (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques, 15, 532-537.
3. Mackey K and Chomczynski P (1996) Long-Term stability of RNA isolation reagents. J NIH Res., 8,72.
4. Ausubel F M, Brent R. Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A and Struhl K (1999) Appendix 1, in: current Protocols in Molecular Biology, vol 2, p. A.1.5, Jon Wiley and Sons, Inc., New York, NY.
5. Chomczynski P and Mackey K (1995) Substituition of chloroform with bromochloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal Biochem, 222, 163-164

OBS: ESTE PRODUTO É UTILIZADO ESTRITAMENTE EM PESQUISA CIENTÍFICA, NÃO RECOMENDADO PARA O USO EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO OU TERAPÊUTICO