Easy Taq DNA Polymerase (recombinante) – Concentração: 5 U/µL – 500U – 13-10500 | -20°C

Catálogo nº: 13-10500
Apresentação: 500 unidades
Concentração: 5,0 U/mL
Armazenamento: – 20ºC
Não armazene em geladeira com sistema frost-free.

DESCRIÇÃO:

A enzima termoestável Taq DNA polimerase de Thermus Aquaticus é a forma recombinante da enzima expressa em Escherichia coli. Apresenta elevada processividade 5’à 3’, e uma atividade de exonuclease 5´- 3´, porém sem atividade exonuclease 3’à 5’.A Taq DNA polimerase mostra excelente atividade em pH 8,5 á 72°C, sendo estável na incubação em elevadas temperaturas (95°C).A enzima é constituída por uma cadeia polipeptídica simples com peso molecular de aproximadamente 94 kDa.

UNIDADE ENZIMÁTICA:

Uma unidade da Taq DNA Polimerase é definida como a quantidade necessária para incorporar 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72°C, em condições de ensaio padrão.

COMPONENTES:

– Enzima Taq DNA Polimerase,
– Tampão de amplificação 10X (livre de íons Mg2+),
– 50 mM de MgCl2

TAMPÃO DE ARMAZENAMENTO:

– 20 mM HEPES pH 7,9
– 100 mM KCl
– 0,1 mM EDTA
– 0,5 mM PMSF
– 1,0 mM DTT
– 50% glicerol

TAMPÃO DE REAÇÃO (10X):

– 100 mM TrisHCl pH 8,5
– 500 mM KCl

ENSAIOS DE CONTROLE DE QUALIDADE:

ATIVIDADE:

SDS-PAGE (pureza),
Espectrometria de massa (Figura 1),

OVER-DIGESTÃO:

A incubação de 5U da Taq DNA Polimerase com 1 mg de DNA, em tampão de reação próprio durante 16 horas à 72°C, fornece um padrão de fragmentos de clivagem nítido, livre de DNA de E.coli [3].

PROTOCOLO BÁSICO DE AMPLIFICAÇÃO:

a) Utilizar microtubos estéreis de 0,2 – 0,5 mL.
Os tubos devem permanecer dentro de gelo.
Detalhes sobre parâmetros críticos e informações adicionais podem ser encontrados na referência [1].
Para obter um excelente rendimento na amplificação de fragmentos de DNA são aconselháveis, a utilização de um kit de pipetas exclusivas, ponteiras com barreira e ambiente livre de contaminação.
O protocolo sugerido serve como um guia geral e ponto inicial de protocolos de amplificação de DNA.
b) Homogeneizar a mistura, através de rápida centrifugação (fast-spin),
c) Incubar em termo bloco à 94°C por 3-5 min, para desnaturar o DNA,
d) Proceder com 20 – 35 ciclos de amplificação: desnaturação à 94°C por 45 s; anelamento à 55°C [**] por 30 s e extensão à 72°C por 1 min. Adicionalmente uma etapa de extensão à 72°C por 10 min é recomendada.
Manter à 4°C até a análise.
e) Analisar os produtos obtidos através de eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida, corando com brometo de etídeo e visualizando em luz ultravioleta.

Bibliografia:

• Innis, M. A. et al. (1990) PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, Ca.
• Chasseing, H. and Lipinski, R. (1998) Characterization of horse kidney metallotionein isoforms by electrospray MS. and reversed-phased HPLC-electrospray MS. Analyst 123: 2125.
• Bornema, J. and Triplet, F. W. (1997) Molecular microbial diversity in soil from Eastern Amazonia: evidence for unusual microrganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Applied and Environmental Microbiology, 63: 2647.

OBS: ESTE PRODUTO É UTILIZADO ESTRITAMENTE EM PESQUISA CIENTÍFICA, NÃO RECOMENDADO PARA O USO EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO OU TERAPÊUTICO