One-Step RT-PCR

One-Step RT-PCR System com Hot Start Taq DNA Polimerase
Cód.: 13-10503-01
100 reações x 50 mL
Armazenar a -20^oC
Produto estável por 10 dias a 37^oC
Transportar a temperatura ambienteSistema para uso em reação de transcrição reversa e reação de polimerização em cadeia em um único tubo (One-Step RT-PCR) contendo as enzimas Transcriptase Reversa M-MLV RNAse Minus e Hot Start Taq DNA Polimerase.

Este kit é estável por 10 dias a 37^oC.

O formato da reação de RT-PCR em um único tubo pode ser empregado em rotinas de biologia molecular com um grande número de amostras diminuindo o risco de contaminações.

Este sistema combina a maior termoestabilidade da enzima Transcriptase Reversa M-MLV RNAse Minus com a especificidade da Hot Start Taq DNA Polimerase para aumentar a especificidade dos iniciadores da reação de PCR, gerando rendimentos superiores dos produtos de amplificação e alta sensibilidade na detecção dos genes alvos.

Devido a mutações de ponto, a enzima Transcriptase Reversa M-MLV RNAse Minus possui atividade de RNAse H reduzida sendo capaz de sintetizar moléculas de cDNA entre as temperaturas de 45^oC a 60^oC. Desta forma, para genes complexos com alto conteúdo de bases GC, a reação de transcrição reversa pode ser realizada na temperatura de 60^oC.

A Hot Start Taq DNA Polimerase possui um anticorpo monoclonal que bloqueia a atividade de polimerase na temperatura ambiente. Esta atividade é restaurada após a incubação por 2 minutos a 95^oC, possibilitando a tecnologia “Hot-start PCR” que garante um maior sensibilidade, especificidade e rendimento dos produtos de PCR.

A solução 2X Tampão de Reação RT-PCR foi desenvolvida para permitir uma eficiente reação de transcrição reversa e especifica reação de PCR contendo 0.4 mM de cada dNTP, 3.2 mM MgSO₄ e estabilizadores da reação de RT-PCR.

Este kit foi otimizado para detecção “end-point” dos produtos amplificados em reações de RT-PCR, permitindo uma fácil análise da expressão de genes alvos ou detecção de RNA viral de agentes infecciosos.
Contém reagentes para a realização de 100 reações com volume final de 50µL incluindo:

Componentes do kit
200uL	Enzimas One-Step RT-PCR	Tampa Vermelha
3 x 1mL	2X Tampão de Reação RT-PCR Tampão contendo 0,4mM de cada dNTPs e 3,2mM MgSO4	Tampa Transparente
1mL	5mM MgSO4	Tampa Branca

Protocolo para reações de RT-PCR

1. Programar o equipamento de PCR para a realização das reações de transcrição reversa (RT) e reação de polimerização em cadeia (PCR) em um único tubo com os seguintes parâmetros de temperatura e tempo de reação:

Transc. Reversa	Ativação Taq	Reação de PCR (40 ciclos)
45oC a 60oC	95oC	Desnaturação	Anelamento	Extensão
15 a 30 minutos	2 minutos	95oC 15 segundos	55o a 65oC 30 segundos	68oC 1 minuto/kb

Opcionalmente, incluir uma etapa final de extensão constituída por um ciclo na temperatura de 68^oC por 5 minutos.
A temperatura ótima da reação de transcrição reversa pode variar entre 45^oC a 60^oC dependendo da sequência alvo e condições da reação. Da mesma forma, a temperatura ótima da etapa de pareamento dos primers (“annealing”) da reação de PCR pode variar entre 55^oC a 65^oC.

2. Preparar a mistura de amplificação da Reação de RT-PCR.

Adicionar os seguintes reagentes para uma reação de volume final 50μL:

2X Tampão de Reação RT-PCR	25μL
Primer Forward (10μM)	1μL	Conc. Final 200nM
Primer Reverse (10μM)	1μL	Conc. Final 200nM
Enzimas One-Step RT-PCR	2μL
RNA ALVO	5μL a 20μL
Água para Biologia Molecular	Completar para 50μL

Para múltiplas reações, preparar uma mistura principal contendo 2X Tampão de Reação RT-PCR, Primer Direto, Primer Reverso, Enzimas One-Step RT-PCR e Água para Biologia Molecular, adicionar o volume correspondente nos microtubos ou poços da microplaca de amplificação e a seguir, adicionar o RNA alvo purificado por um kit ou reagente de biologia molecular.

3. Fechar os microtubos ou microplaca de amplificação.

4. Colocar os microtubos ou microplaca no termociclador e iniciar a reação de RT-PCR.

Notas sobre a otimização da Reação de RT-PCR:
– Concentração de MgSO₄    
A solução 2X Tampão de Reação RT-PCR contém sulfato de magnésio para concentração final de 1,6mM. Esta concentração geralmente é suficiente para a maioria dos alvos de RNA. Caso o usuário tenha o interesse de otimizar a reação de RT-PCR, adicionar a solução de 5mM MgSO₄ conforme os volumes apresentados abaixo:

Reações de RT-PCR com volume final de 50μL:

Concentração Final de MgSO4	2,0mM	2,4mM	2,8mM
Volume adicional de 5mM MgSO4	4μL	8μL	12μL

• Disponibilidade: produto feito sob encomenda
• Pagamento no momento do pedido: 100% de sinal