Taq DNA Polimerase 5U/µl 5 x 500 U

Taq DNA Polimerase 5 x 500 U

Concentração: 5 U/µl
Condição de estoque: –20°C
Apresentação:

• 5 frascos de Taq DNA Polimerase 500 U
• 5 frascos de MgCl2 1,25 ml
• 5 frascos de Tampão 10X 1,5 ml

Descrição: Taq DNA Polimerase é purificada de E. coli expressando um gene de DNA polimerase clonado de Thermus aquaticus. Esta enzima tem atividade de DNA polimerase 5’ a 3’ e atividade de exonuclease 5’ a 3’, mas não possui atividade de exonuclease 3’ a 5’. A enzima inalterada consiste de uma cadeia polipeptídica simples com um peso molecular de aproximadamente 94 kDa. Ela exibe alta atividade em pH 8.5, com temperatura ótima a 72°C e é estável por longas incubações a elevadas temperaturas (95°C).

Definição de unidade: Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que incorpora 10 nmoles de nucleotídeos em material ácido-insolúvel em 30 minutos a 72°C em condições padrão de ensaio.

Tampão de estoque: 50% glicerol, 20 mM HEPES (pH 7.9), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT.

Tampão 10X: 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 500 mM KCl (sem adição de MgCl2, que é fornecido em frasco separado na concentração de 50 mM).

Protocolo Básico de Amplificação: O seguinte protocolo básico serve como uma orientação geral e um ponto de partida para qualquer amplificação. As condições ótimas da reação (tempos e temperaturas de incubação, a concentração de Taq DNA polimerase, primers, MgCl2 e DNA molde) variam e precisam ser otimizadas. A PCR deve ser realizada em um ambiente livre de DNA contaminante.

a) Adicione os seguintes componentes em um tubo estéril de microcentrífuga no gelo:

Se desejado, um Master Mix pode ser preparado para reações múltiplas.

b) Misturar o conteúdo e adicionar 50 µl de óleo mineral ou óleo de silicone.
c) Centrifugar brevemente.
d) Incubar os tubos em um termociclador a 94°C por 2 minutos para desnaturar completamente o DNA molde.
e) Realizar 25-35 ciclos de amplificação: desnaturação a 94°C por 45 segundos; anelamento a 55°C [geralmente 5-10°C abaixo da Tm] por 30 segundos; e extensão a 72°C por 1 minuto.
f) Incubar por 10 minutos a 72°C. Manter a reação a 4°C ou estocar a -20°C até o uso.
g) Analisar os produtos de amplificação por eletroforese em gel de agarose e visualizar com brometo de etídio.

Utilizações

1. Amplificação de DNA por PCR: Utilizado para aumentar a quantidade de DNA a partir de pequenas amostras, essencial para diversas aplicações de pesquisa e diagnóstico.
2. Clonagem de Genes: Amplifica sequências de DNA para inserção em vetores de clonagem, facilitando a construção de plasmídeos recombinantes.
3. Sequenciamento de DNA: Amplificação de fragmentos de DNA específicos antes do sequenciamento, melhorando a precisão e a qualidade dos dados de sequenciamento.
4. Detecção de Patógenos: Identificação de agentes infecciosos em amostras clínicas, como bactérias e vírus, através da amplificação de sequências específicas de DNA.
5. Genotipagem: Determinação de variantes genéticas, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e outras mutações genéticas.
6. Estudos de Expressão Gênica: Amplificação de cDNA para análise da expressão de genes, permitindo a quantificação e comparação da expressão gênica em diferentes condições.
7. Desenvolvimento de Testes Diagnósticos: Criação de ensaios de PCR para diagnóstico de doenças genéticas, infecciosas e oncológicas.
8. Análise de Marcadores Moleculares: Identificação de marcadores moleculares em estudos de genética de populações, melhoramento genético e biologia evolutiva.
9. Verificação de Transgênicos: Confirmação da presença e integração de genes transgênicos em organismos geneticamente modificados (OGMs).
10. Investigação Forense: Amplificação de DNA de amostras forenses, como sangue, cabelo e saliva, para identificação de indivíduos em casos criminais.

11. Estudos de Metagenômica: Amplificação de DNA de amostras ambientais para identificar e caracterizar comunidades microbianas.
12. Diagnóstico Pré-Natal: Detecção de anomalias genéticas em fetos através da amplificação de DNA extraído de células fetais ou DNA fetal livre em circulação.
13. Identificação de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs): Verificação da presença de sequências específicas em plantas e animais geneticamente modificados.
14. Monitoramento de Biodiversidade: Amplificação de DNA ambiental para estudar a diversidade genética de espécies em ecossistemas naturais.
15. Estudos de Epigenética: Investigação de modificações epigenéticas, como metilação do DNA, através da amplificação de regiões específicas do genoma.
16. Análise de Variantes Virais: Amplificação de regiões do genoma viral para estudo de variantes e mutações emergentes, crucial para vigilância epidemiológica.
17. Investigação de Câncer: Identificação de mutações e rearranjos genéticos associados ao câncer, facilitando a pesquisa e o desenvolvimento de terapias personalizadas.
18. Desenvolvimento de Vacinas: Amplificação de genes de interesse para a criação de vacinas baseadas em DNA.
19. Ensaios de RT-PCR em Tempo Real: Utilização em RT-PCR para quantificação em tempo real de RNA, importante para estudos de expressão gênica e diagnóstico molecular.
20. Pesquisa de Biologia Sintética: Amplificação de fragmentos de DNA para a construção de circuitos genéticos e organismos geneticamente modificados em biologia sintética.

Essas utilizações demonstram a versatilidade da Taq DNA Polimerase em diversas áreas da biologia molecular e biotecnologia.