Tripsina 0,25%, 10x em HBSS BR30045-01

CARCTERÍSTICAS: É uma solução balanceada com tripsina de origem suína isenta dos íons Cálcio e Magnésio. A concentração desta solução é 10X, necessitando ser diluída para concentração 1X no momento do uso. Em sua composição o EDTA atua como agente quelante. Permite o “descolamento” das células de frascos de cultivo e/ou desagregando células entre si através de sua propriedade proteolítica sobre proteínas intercelulares, e ainda alterando a estabilidade das membranas ao quelar o íon cálcio.

APLICAÇÃO: Este tampão é indicado na separação de células de órgãos e/ou tecidos, ou mesmo cultivados em mono-camadas ou camadas múltiplas. Como o processo de descolamento e separação de células é feito geralmente ao microscópio, é possivel controlá-lo, interrompendo a sua ação, através da adição de meio contendo soro animal ou humano.

COMPONENTES E CARACTERÍSTICAS FÍSICOQUIMICAS:
· Tripsina, EDTA, HBSS modificado e bicarbonato de sódio,
· Aspecto: límpido e transparente
· pH: 7,0 + 0,2

CONSERVAÇÃO: Descongelar apenas no momento de uso. Por se tratar de uma enzima proteolítica, ela pode sofrer auto-digestão com diminuição de sua atividade. A alteração para valores mais próximos de 7,9 e sua utilização à 37oC provocam um aumento de atividade, ocorrendo o inverso com diminuição do pH e da temperatura.

PARA REMOVER CÉLULAS DE CULTURAS ADERIDAS AO FRASCO:
1. Remova por inversão ou por aspiração todo o meio do frasco de cultivo.
2. Adicione aproximadamente 0,1 ml/cm2 da solução de Tripsina/EDTA para lavar rapidamente a superfície de células. Essa manobra é rápida e serve para remover o soro remanescente. Pode-se utilizar meio de cultura ou solução  balanceada em maior quantidade, mas sem soro, o que permitirá maior economia da Solução de Tripsina.

3. Adicionar aproximadamente 0,05 mL/cm2 da Solução de Tripsina/EDTA sob a superfície celular e observar ao microscópio. Quando as células
adquirirem um aspecto redondo e individualizado, deslocando-se do tubo, pode-se interromper o processo com a adição de 0,2 ml/cm² de meio com soro à 10%. Como o soro possui alfa 1-antitripsina, ele neutralizará a ação da tripsina. Quando se trabalha com monocamadas celulares que ocupam todo o frasco, o descolamento pode ser observado a olho nu e o meio se apresentará como se tivesse uma fina areia. É importante que a neutralização com soro se faça logo após o descolamento da camada celular, uma vez que a membrana, por ser lipo-protéica, sofre a ação proteolítica da tripsina.
4. A seguir, as células são homogeneizadas e contadas para diluição, congelamento, repiques celulares, etc.
PARA REMOVER CÉLULAS DE ÓRGÃOS OU TECIDOS:
1. Lavar bem o órgão ou tecido em meio sem soro.
2. Com o auxílio de uma tesoura de íris, picotar o órgão em pedaços bem pequenos (+1mm).
3. Aspirar todo o sobrenadanete (os pedaços geralmente não flutuam).
4. Adicionar Tripsina/EDTA em volume de 3 a 10 vezes o correspondente do tecido picotado.
5. Agitar lentamente em um Erlenmayer, com o auxílio de um agitador magnético com imã revestido de PTFE e estéril. O tempo de coleta da Tripsina com células pode ser com intervalos de 10, 20 ou 30 minutos.
6. Após o tempo de ação da solução de Tripsina aspirar o sobrenadante e, vertê-los para tubos contendo meio completo com soro à 10%. A proporção será de volume a volume, isto é, para cada 10 ml de sobrenadante, misturar outro ml de meio completo com soro. Veja que a extração de células do Erlenmayer poderá continuar a ser feita, bastando para isso adicionar mais Tripsina/EDTA.
7. Centrifugar por 10 minutos à 1000 RPM os tubos contendo Tripsina com meio completo, desprezar o sobrenadante e adicionar novo meio completo.
8. Homogeneizar e distribuir as células em frascos de cultivo de acordo com a vitalidade e densidade celular desejada.